Влияние пептида NTQATNRNTD на аномальный фибриллогенез лизоцима

Егоров В.В. (v.v.e@bk.ru), Грудинина Н.А., Соловьев К.В.

ГУ НИИ Экспериментальной медицины РАМН

Введение. Конформационные заболевания - это группа заболеваний, при которых нарушение нормальных физиологических и появление аномальных свойств белков связаны с изменением их пространственной структуры [5]. Значительная часть конформационных болезней представляет собой различные типы амилоидозов. Возникновение амилоидозов связано с накоплением нерастворимых фибриллярных форм белков в органах и тканях. К амилоидозам относятся такие известные заболевания как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные заболевания. При диабете типа 2 образование амилоида также является одним из звеньев патогенеза [2]. Амилоидозы являются широко распространенной группой заболеваний. Так, например, в настоящее время, болезнь Альцгеймера обнаружена у 12 млн. людей по всему миру [5]. По различным данным, амилоидоз мозга гистохимически выявляется у 3046% психически здоровых людей в возрасте старше 60 лет и у 80-100% людей старше 85 лет [1,5]. Несмотря на существенный прогресс в понимании механизмов фибриллогенеза, до сих пор не существует эффективных средств для лечения амилоидозов.

Процесс аномального фибриллогенеза различных белков протекает сходным образом и подчиняется общим закономерностям [5]. Поэтому в качестве моделей для разработки стратегии борьбы с амилоидозами могут быть использованы различные фибриллогенные белки, в частности, лизоцим куриного яйца.

Лизоцим (ЕС 3.2.1.17) - это белок с молекулярной массой 14,6 кДа, состоящий из 129 а.о. Лизоцим катализирует гидролиз бета (1-4) гликозидных связей между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином мукополисахаридов бактериальной стенки. В организме человека он был обнаружен в селезенке, легких, почках, лейкоцитах, молоке, слезах и слюне. Фибриллогенез лизоцима человека, гомологичного лизоциму куриного яйца на 67%, является причиной возникновения системных амилоидозов [7]. В настоящее время известны две аминокислотные замены, приводящие к повышенной амилоидогенности лизоцима. Амилоидоз, связанный с фибриллогенезом лизоцима приводит к смерти больных в пятой декаде жизни [8]. Описаны также случаи вторичной открытоугольной глаукомы, при которых амилоидные отложения лизоцима обыли обнаружены в тканях глаза [7].

Пространственная структура лизоцима хорошо изучена и разработаны методы, позволяющие изучать изменение структуры лизоцима в различных условиях. Поэтому лизоцим является хорошей моделью для испытания in vitro новых фармакологических препаратов для борьбы с амилоидозами [6].

Целью нашей работы являлось создание пептида, способного влиять на фибриллогенез лизоцима.

Материалы. Для приготовления буферов использовали реактивы фирмы SERVA. Пептид NTQATNRNTD был

синтезирован в ООО «НПФ «Верта» », чистота более 90%. Использовали лизоцим куриного яйца фирмы SIGMA.

Получение фибрилл лизоцима. Лизоцим (5 мг/мл) в буфере 0.1 М NaCl, 1 М Gly-HC1 рН 2.0 инкубировали при температуре 55 °С при постоянном перемешивании в течение 5 суток.

Электронная микроскопия фибрилл. Подготовку препаратов для электронной микроскопии осуществляли по стандартной методике негативного контрастирования. Каплю (20 мкл) исследуемого образца, разбавленного до концентрации 0.2 мг/мл наносили на парафильм. На каплю помещали 200-ячеечную медную подложку с углеродным покрытием. После 15 с. сорбции подложку два раза по 15 с. отмывали дистиллированной водой и контрастировали 1.5% раствором натриевой соли фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7.4) в течение 15 с. Образец высушивали при комнатной температуре, затем производили исследование на электронном микроскопе TESLA BS100 (БИН РАН) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Результаты и обсуждение. В работе [3] было показано, что в переходных состояниях, предшествующих фибриллогенезу лизоцима куриного яйца, альфа-домен этого белка остается структурированным, в то время как бета-домен теряет свою вторичную структуру. Кроме того, было показано [4], что фрагмент бета-домена лизоцима куриного яйца 49-63 а.о. (GSTDYGILQINSRWWS) способен формировать фибриллы.

Участок, соответствующий фибриллогенному пептиду, в пространственной структуре белка представляет собой два бета-тяжа (рисунок 1, обозначено черным). Эти тяжи находятся в контакте с третьим, соответствующим 39-48 а. о. (рисунок 1, обозначено белым).